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干细胞、原代细胞基质胶Biozellen®3D
干细胞、原代细胞基质胶Biozellen®3D
干细胞、原代细胞基质胶Biozellen®3D
Biozellen®3D 类器官培养基质胶套装
Catalog No.： B-P-00003-2、B-P-00003-4、B-P-00003-10
Specification ：2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit
Storage：根据组分保存温度要求储存. 1 年保存.
一、产品描述
Biozellen®3D 类器官培养基质胶套装包含整套基质胶、胶体固定液、胶体溶解液，可应用到 3D 细胞培养 与微环境应用等；本试剂盒操作便利且可调控基质胶硬度进行多种细胞培养测试；植物胶体可快速形成水 凝胶， 请操作前详细阅读此使用指南。
（Biozellen®3D 类器官培养基质胶材料为植物来源，无动物成分）
二、应用
•3D 类器官培养。
•3D 细胞球体培养试验
•细胞侵袭
•细胞迁移
•小鼠皮下成瘤
•适合用于 3D 细胞药物筛检平台
•细胞生长和分化
•代谢/毒理学研究
•体外和体内血管生成分析
三、适用细胞种类
• 原代细胞 • 干细胞
四、试剂盒组分
五、使用步骤：
A、试剂制备
A 基质胶：将 A 基质胶溶于 37℃水浴槽回温 10 分钟， 确认完全融解.
C 缓冲溶液(1X)制备：使用前将 10X C 缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如： 无血清 DMEM、opt-MEM) 制 备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .
D 缓冲溶液(1X)制备: 使用前用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.
B、Biozellen®3D 类器官培养基质胶的制备 全部步骤需要在无菌环境内操作，操作步骤如下：
1. 将 24 孔培养板放置于冰箱或者冰上预冷。
2. 细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5ml 37℃ 培养基均匀混合，并与 0.5ml 37℃ A 胶按照 1:1 等 比例均匀混合，最终细胞密度 1*105~1*107cells/mL。
注：请选择适当的培养溶液与条件进行试验。
3.取 20-40 微升步骤 2 含细胞的混合 A 胶溶液滴于 步骤 1 预冷的培养板上，胶体将于 5 分钟内成胶。 注: 测试胶体是否成胶，可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。
Catalog No.： B-P-00003-2、B-P-00003-4、B-P-00003-10
Specification ：2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit
Storage：根据组分保存温度要求储存. 1 年保存.
一、产品描述
Biozellen®3D 类器官培养基质胶套装包含整套基质胶、胶体固定液、胶体溶解液，可应用到 3D 细胞培养 与微环境应用等；本试剂盒操作便利且可调控基质胶硬度进行多种细胞培养测试；植物胶体可快速形成水 凝胶， 请操作前详细阅读此使用指南。
（Biozellen®3D 类器官培养基质胶材料为植物来源，无动物成分）
二、应用
•3D 类器官培养。
•3D 细胞球体培养试验
•细胞侵袭
•细胞迁移
•小鼠皮下成瘤
•适合用于 3D 细胞药物筛检平台
•细胞生长和分化
•代谢/毒理学研究
•体外和体内血管生成分析
三、适用细胞种类
• 原代细胞 • 干细胞
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A、试剂制备
A 基质胶：将 A 基质胶溶于 37℃水浴槽回温 10 分钟， 确认完全融解.
C 缓冲溶液(1X)制备：使用前将 10X C 缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如： 无血清 DMEM、opt-MEM) 制 备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .
D 缓冲溶液(1X)制备: 使用前用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.
B、Biozellen®3D 类器官培养基质胶的制备 全部步骤需要在无菌环境内操作，操作步骤如下：
1. 将 24 孔培养板放置于冰箱或者冰上预冷。
2. 细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5ml 37℃ 培养基均匀混合，并与 0.5ml 37℃ A 胶按照 1:1 等 比例均匀混合，最终细胞密度 1*105~1*107cells/mL。
注：请选择适当的培养溶液与条件进行试验。
3.取 20-40 微升步骤 2 含细胞的混合 A 胶溶液滴于 步骤 1 预冷的培养板上，胶体将于 5 分钟内成胶。 注: 测试胶体是否成胶，可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。
4.待胶体成胶后，添加 1 毫升冰的 1X C 缓冲溶液，并盖过步骤 3 的胶溶液，固定 15 分钟。
5.待 15 分钟固定后，小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。
6 将含有细胞的胶于 37°C 二氧化碳培养箱内进行 7~14 天的培养，并观察细胞球体的形成，按正常培养基 更换频率进行更换操作。
C、溶胶与收集细胞球体准备程序
小心的将培养基吸取移除，并用 1X PBS 进行清洗。
小心的将 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的 D 缓冲溶液，盖过胶滴于室温反应 5 分钟。 温和的用 1 毫升移液管吸取，直到胶滴完全溶解。
将含有细胞球体的溶液吸入 1.5 毫升离心管，用 1000 rpm 的转速离心 10 分钟，移除上清液体并收集细胞 球体做分析。
D、收集单颗细胞准备程序 在分离单细胞前，先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作 1. 添加 trypsin-EDTA 并与收集的细胞球体于 37°C 混合反应。
2. 用 1 毫升移液管混合，直到细胞体完全分解。
3. 待细胞球体完全分解，加入 3 倍体积的 1X PBS，并用 1000 转的转速进行离心 10 分钟，并移除上清 液体收集沉淀的单细胞做分析。
E、细胞迁移实验准备程序
1. 准备 Transwell 装置及无血清 DMEM 细胞培养液 (用于稀释 A 胶)。
2. A 胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于 37 ℃水浴槽回温 10 分钟，确认完全融解。
3. 用无血清 DMEM 细胞培养液将 A 胶 (2X)稀释 50 倍。
4. 根据 Transwell 上室底部面积加入 100-120 ul/cm2 稀释后的 A 胶稀释液到 Transwell 上室中。
5. 将步骤 4 在 4 ℃冰箱孵育 30 分钟。
6. 将多余的稀释液吸出，并在 Transwell 上室中加入无血清的癌细胞系细胞悬浮液使细胞浓度约 7.5 x 104 cells/well.。
7. 在 Transwell 下室中加入含 10 %血清的细胞培养液做为 chemoattractant，吸引癌细胞系进行迁移。
F、细胞侵袭实验准备程序
1. 准备 Transwell 装置及无血清 DMEM 细胞培养液 (用于稀释 A 胶)。
2. A 胶 (2X) (货号: B-P-00003-A) 置于 37 ℃水浴槽回温 10 分钟，确认完全融解。
3. 用无血清 DMEM 细胞培养液将 A 胶 (2X)稀释 1-2 倍。
4. 根据 Transwell 上室底部面积加入 70-80 ul/cm2 稀释后的 A 胶稀释液到 Transwell 上室中。
5. 将步骤 4 在 4 ℃冰箱或者冰上孵育 10 分钟（最好用冰包埋起来）。
6. 用冰的无血清细胞培养液 稀释 C 缓冲溶液(10X) (货号: B-P-00003-C ) 至 1X C 缓冲溶液。(不可用 PBS 稀释).
7. 步骤 5 孵育时间结束后再加入 70-80 ul/cm2 预冷稀释后的 1X C 缓冲溶液。 (C 缓冲溶液用于 A 胶成胶 反应)
8. 将步骤 7 在 4 ℃冰箱或者冰上孵育 15 分钟（最好用冰包埋起来）。
6. 形成胶体后，将多余的稀释液吸出。
7. 在成胶完成的 Transwell 上室中加入无血清的癌细胞系细胞悬浮液使细胞浓度约 7.5 x 104 cells/well.。 7. 在 Transwell 下室中加入含 10 %血清的细胞培养液做为 chemoattractant，吸引癌细胞系进行迁移及分 泌基质蛋白酶 (MMP) 侵袭。
G、小鼠皮下成瘤实验准备程序
1. 将 A 胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于 37 ℃水浴槽回温 10 分钟，确认完全融解。
2. 将 C 缓冲溶液(10X) 货号:B-P-00003-C)与冰的无血清细胞培养液 (例如: 无血清 DMEM 或内含 VEGF、heparin 的无血清 DMEM) 按 1:4 比例均勻混合配置。(例如:1 ml C 缓冲溶液(10X) 與 4 ml 无血清DMEM 混合，不可用 PBS 稀释)
5.待 15 分钟固定后，小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。
6 将含有细胞的胶于 37°C 二氧化碳培养箱内进行 7~14 天的培养，并观察细胞球体的形成，按正常培养基 更换频率进行更换操作。
C、溶胶与收集细胞球体准备程序
小心的将培养基吸取移除，并用 1X PBS 进行清洗。
小心的将 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的 D 缓冲溶液，盖过胶滴于室温反应 5 分钟。 温和的用 1 毫升移液管吸取，直到胶滴完全溶解。
将含有细胞球体的溶液吸入 1.5 毫升离心管，用 1000 rpm 的转速离心 10 分钟，移除上清液体并收集细胞 球体做分析。
D、收集单颗细胞准备程序 在分离单细胞前，先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作 1. 添加 trypsin-EDTA 并与收集的细胞球体于 37°C 混合反应。
2. 用 1 毫升移液管混合，直到细胞体完全分解。
3. 待细胞球体完全分解，加入 3 倍体积的 1X PBS，并用 1000 转的转速进行离心 10 分钟，并移除上清 液体收集沉淀的单细胞做分析。
E、细胞迁移实验准备程序
1. 准备 Transwell 装置及无血清 DMEM 细胞培养液 (用于稀释 A 胶)。
2. A 胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于 37 ℃水浴槽回温 10 分钟，确认完全融解。
3. 用无血清 DMEM 细胞培养液将 A 胶 (2X)稀释 50 倍。
4. 根据 Transwell 上室底部面积加入 100-120 ul/cm2 稀释后的 A 胶稀释液到 Transwell 上室中。
5. 将步骤 4 在 4 ℃冰箱孵育 30 分钟。
6. 将多余的稀释液吸出，并在 Transwell 上室中加入无血清的癌细胞系细胞悬浮液使细胞浓度约 7.5 x 104 cells/well.。
7. 在 Transwell 下室中加入含 10 %血清的细胞培养液做为 chemoattractant，吸引癌细胞系进行迁移。
F、细胞侵袭实验准备程序
1. 准备 Transwell 装置及无血清 DMEM 细胞培养液 (用于稀释 A 胶)。
2. A 胶 (2X) (货号: B-P-00003-A) 置于 37 ℃水浴槽回温 10 分钟，确认完全融解。
3. 用无血清 DMEM 细胞培养液将 A 胶 (2X)稀释 1-2 倍。
4. 根据 Transwell 上室底部面积加入 70-80 ul/cm2 稀释后的 A 胶稀释液到 Transwell 上室中。
5. 将步骤 4 在 4 ℃冰箱或者冰上孵育 10 分钟（最好用冰包埋起来）。
6. 用冰的无血清细胞培养液 稀释 C 缓冲溶液(10X) (货号: B-P-00003-C ) 至 1X C 缓冲溶液。(不可用 PBS 稀释).
7. 步骤 5 孵育时间结束后再加入 70-80 ul/cm2 预冷稀释后的 1X C 缓冲溶液。 (C 缓冲溶液用于 A 胶成胶 反应)
8. 将步骤 7 在 4 ℃冰箱或者冰上孵育 15 分钟（最好用冰包埋起来）。
6. 形成胶体后，将多余的稀释液吸出。
7. 在成胶完成的 Transwell 上室中加入无血清的癌细胞系细胞悬浮液使细胞浓度约 7.5 x 104 cells/well.。 7. 在 Transwell 下室中加入含 10 %血清的细胞培养液做为 chemoattractant，吸引癌细胞系进行迁移及分 泌基质蛋白酶 (MMP) 侵袭。
G、小鼠皮下成瘤实验准备程序
1. 将 A 胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于 37 ℃水浴槽回温 10 分钟，确认完全融解。
2. 将 C 缓冲溶液(10X) 货号:B-P-00003-C)与冰的无血清细胞培养液 (例如: 无血清 DMEM 或内含 VEGF、heparin 的无血清 DMEM) 按 1:4 比例均勻混合配置。(例如:1 ml C 缓冲溶液(10X) 與 4 ml 无血清DMEM 混合，不可用 PBS 稀释)
3. 将 A 胶 (2X) 与约 2*106 cells/ml 的癌细胞系悬浮液按 1:1 等比例均匀混合配置，癌细胞系悬浮液最终 浓度约为 106 cells/ml。
4. 选用 21-25 G 的针头 (避免破坏细胞)，抽取 0.2-0.3 ml 预冷稀释后的 C 缓冲溶液。(C 缓冲溶液用于 A胶成胶反应)
5. 使用步骤 4 的同一支针管，再抽取 0.1-0.7 ml 含细胞的 A 胶混合液，在冰上孵育五分钟。
6. 以皮下注射方式注射 0.3-1.0 ml 至小鼠。(需一次注射完含 C 缓冲溶液的 A 膠混合液) 注 1: 注射体积可依不同实验目的做调整，若为血管生成研究注射体积需至少 0.5 ml。
注 2: 此步骤依实验需求可执行或不执行，若需呈现明显的皮下注射隆起效果，可于注射完毕后，在小鼠注射部位冰敷 5-10 分钟。
7. 培养一至三周后可摘取接种的肿瘤组织。
注 3: 若为血管生成研究，应注射含 VEGF 及 heparin 的 A 胶，以促进血管生成。约三天后，可摘取含有 新血管生成的肿瘤组织。
六、案例分享
A.形成 3D 肿瘤球体成功案例分享
B.Biozellen 基质胶被溶解后分离的完整 3D 细胞结构照片
培养后的 3D 细胞球体， 在 Biozellen 基质胶被试剂盒里面的
D Buffer 溶解分离后仍然可以得到完整的 3D 细胞结构
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